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本试剂盒是基于SP6 RNA聚合酶的RNA体外转录试剂盒，它利用含有SP6启动子的模版DNA，以NTP为底物，从SP6启动子下游开始合成与模版DNA中一条链互补的RNA，简单快速获得大量的RNA分子。

• 即开即用，用户只需提供含SP6启动子的DNA模板即可以进行体外转录实验。
  
• 单溶液预配液，减少加样次数，避免了操作误差，增加了可重复性。
  
• 模版DNA可以是线性化的质粒DNA，也可以是PCR扩增产物。
  
• 可以合成的RNA的最佳长度在20nt到2000nt之间。
  
• 产品配方经过精心优化，每ug DNA模版可以合成2～6μg RNA。
  
• 得到的RNA可以用于RNA结构研究、核酶生物化学、体外翻译、RNA-蛋白质相互作用、反义技术、SELEX技术和RNA干扰（RNAi）等实验。
  
• 本制品足够50次20μL的体外转录实验。本制品只能用于科研。

• 必须使用线性化的DNA。如果是质粒DNA，则必须先用适当的限制性内切酶切成线状。
  
• 需要转录的DNA序列的上游必须有SP6启动子。如果模板是PCR产物，则可以在设计引物时将SP6启动子序列（5’ATT TAG GTG ACA CTA TAG AGN G 3’）加上，转录其实是从3端G AGN G中的第一个G开始。如果是将DNA片段克隆到载体上，则需要选择有SP6启动子的载体，并且克隆位点必须位于SP6启动子下游。
  
• 需要转录的DNA序列的下游端最好不要是3’突出。如果是3’突出（如选择了Pst I来线性化质粒），则最好用T4 DNA聚合酶修平。
  
• 必须保证DNA模板中没有RNase。由于提取质粒DNA的过程中一般要使用大量的RNase A，因此质粒DNA一般都有严重的RNase A污染，所以在用作模板前，最好采取胶回收得方法回收质粒DNA。并且加入少量总RNA一起保温，然后电泳检测RNA是否被降解，以此判断纯化的DNA模板是否有残留RNase A。

• 如果有N个样品，强烈建议做一个阴性对照，故共设置N+1个反应，这样一起并排电泳时容易判断哪个条带是模板DNA，哪个条带是扩增得到的RNA。在N+1个RNase-free的塑料离心管中，在室温下（不是在4℃下）按次序加入下列成分（T7转录预配液容易产生结晶沉淀，一定要握在手中直到结晶彻底溶解并摇匀后方可使用）：
  

  成分	N个样品管	阴性对照管
  DNA模板	50ng左右的PCR片段或1μg左右的线状质粒DNA	不加
  2×SP6转录预配液	各10μL	10μL
  SP6 RNA聚合酶-RI混合液	各1μL	1μL
  RNase-free water	至20μL	至20μL

  注：此为20μL反应体系的用量，对其他反应体系，各成分的用量可以按比例增减。如果需要标记RNA探针，则需要单独订购NTP分开的试剂盒。如果需要得到加帽RNA，则需要另外加入自备的加帽修饰核苷酸（可以从NEB购买）。
  
• 37℃保温1～2小时。注意：延长保温时间并不能提高产量。
  
• 70℃加热10分钟灭活SP6 RNA聚合酶。
  
• 取1～3μL电泳检测转录效果。此时除DNA marker外，最好再用DNA模板做电泳对照。电泳时比阴性对照多出的条带就是扩增得到的RNA（由于合成的RNA长度不均匀，即使长度均匀，但由于自生形成发夹结构，泳动速度也不一致，所以电泳所得RNA条带一般都不是清晰，而是比较弥散的电泳条带。但由于RNA是单链，分子量比同样长度的DNA小一倍，因此转录得到的RNA一般比其双链的DNA模板电泳速度更快
  
• 定量，可以用自备的单链RNA定量试剂盒检测浓度，也可以肉眼比较电泳胶上RNA和DNA的强度。由于RNA是单链，跟核酸染料结合力低，因此同等亮度的RNA条带，其RNA分子数一般比DNA的分子数多一倍。使用本试剂盒时1μg DNA模板一般可以合成2～6μg的RNA
  
• 得到的RNA可以放-80℃保存或立即使用。

• 在体外转录体系中加入3～5U自备的DNase溶液(货号：BTN90903，无RNase活性，3～5U/μL）。
  
• 37℃保温15～30分钟降解DNA。
  
• 补水到100μL（体积太小不方便下步的酚氯仿抽提）。
  
• 用等体积的Tris饱和酚-氯仿抽提一次去除残留的DNase和RNA聚合酶。
  
• 在上清中加200μL自备的微量核酸沉淀剂(货号：BTN50903，用前需要摇晃混匀），振荡后15000rpm离心3～5分钟，弃上清。
  
• 加入1mL 75%乙醇，震荡10秒后15000rpm离心3～5分钟，弃上清。
  
• 短暂离心数秒，用枪头吸弃上清。
  
• 晾干半分钟，所得沉淀即去除DNA模板后的RNA。可溶于RNase-free水中后立即使用或放-80℃长期保存。

• 没有RNA产物。最常见原因是模板有RNase污染，可用纯化的RNA跟模板DNA一起保温，再检测RNA是否降解。还可以增加RNase Inhibitor用量，本试剂盒缓冲液和酶混合液中有RNase inhibitor，如果模板RNase污染严重，可能需要用户补加RNase inhibitor。
  
• RNA产量低。最常见的原因是DNA模板。在转录序列的第一个和第二个碱基最好都是G，在前14个碱基内避免有U存在。
  
• RNA长度比预期的短。可能是模板序列中有SP6 RNA聚合酶的终止序列。可以改用SP6体外转录试剂盒（启动子也必须改成SP6启动子）。
  
• RNA长度比预计的长。SP6 RNA聚合酶跟Taq DNA聚合酶一样，有不依赖于模板的加尾功能，最多有一半的RNA可以带一个或两个碱基的尾巴。如果RNA长度比预计的长很多，使用的模板又是质粒DNA，则可能是线性化不彻底。
  
• 5’单磷酸还是三磷酸。如果使用GTP，则得到的RNA是三磷酸，体外转录时如果保温时间太长（如12小时），则有50%的三磷酸会变成单磷酸。如果在转录体系中加入GMP，则SP6 RNA聚合酶将优先使用GMP，所得RNA产物中5’端是单磷酸的比例将大大增加。
  
• 如何得到带帽RNA？需加入带帽NTP类似物即可。